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鱟血變形細胞裂解物的制備

發布時間: 2023-10-13  點擊次數: 1201次
我們了解到,鱟血液中含有一種細胞即變形細胞,這種細胞內的溶解物(裂解物tachypleus lysate,TL)可與微量細菌內毒素起凝集反應,這是由TL中的一種酶被細菌(革蘭陰性菌)細胞壁成分——脂多糖激活,使其蛋白質形成凝膠所致。為此人們已闡明了這方面的理論機制,并已著手利用各種技術從自然界存在的某些物質中把它提取出來,實踐并應用于社會,鱟變形細胞內的溶解物主要有兩種,凝固蛋白原及凝固蛋白酶原。這兩種物質提取后,即為檢測內毒素的益試劑,它的檢測靈敏度高低取決于制備擻血細胞溶解物的質量。因此,在制備提取過程中不能有微量的內毒素進入,所以,鱟試劑的制備提取過程是有相當難度的。

一、材料與制備
1、鱟

采用我國東南沿海地區的鱟即東方鱟(中國鱟),采血量最多為400ml,平均200ml(需根據體重大小而定),其變形細胞數最高為5×1011/L以上,平均為4×1010/L。

2、器材及處理

準備采血瓶(250ml玻璃瓶)注射器等用具,經洗滌后放在重鉻酸鉀與硫酸的清潔液中浸泡過夜,然后用無內毒素的流水沖洗3次,晾干后于260℃烤箱內烘干3h備用。采血針、管均需用一次性無菌采血器(均無內毒素)。

3、試劑配制

以下試劑中凡是固體試劑均需預先去除內毒素,去內毒素的方法要視各種試劑的耐熱度而定,一般用80~120℃不間斷烘烤約10h左右。配制試劑用的重蒸餾水應不含內毒素(小于0.03EU/ml內毒素含量)。

  1. 抗凝劑1:茶-堿(theophylline)2g;磷-酸-氫-二-鈉(Na2HPO4·12H2O)2g;氯化鈉40g;無內毒素蒸餾水1000ml。

  2. 抗凝劑2:茶-堿0.36g;磷-酸-氫-二-鈉2g;氯化鈉4g;無內毒素蒸餾水1000ml。

(3)洗滌液:磷-酸-氫-二-鈉2g;氯化鈉40g;無內毒素蒸餾水1000ml。

(4)裂解液:將0.05mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)用鹽酸調節至pH值為7左右,也可加入二價陽離子如Ca2+、Mg2+、Mn2+等提高靈敏度。
二、制備步驟

1、采血 
取活鱟用水沖洗,將鱟屈曲,露出頭、胸、腹三節交界處,用碘酒擦拭后用酒精消毒。取15G針頭一次性輸血器,針尖插入盛有100ml抗凝劑1的瓶中,另一端的針頭刺入鱟的頭腹部關節處深入約1~2cm,藍色血液就流入瓶內,每瓶采血100ml,注意穩定針頭,使其不要移動。在采血過程中,鱟血應是順暢地流入瓶中,若發生間歇滴入就容易凝固,應即棄去不用。采血后立即用1000r/min離心約2min。離心后,變形細胞沉積于瓶底,呈白色,此時棄去上層藍色血液即可。


2、洗滌
用抗凝劑2-20ml加入瓶中輕輕搖晃,使沉淀的變形細胞均勻地分散混懸于抗凝劑中,然后以1000r/min離心1min。棄去上清液后用4%氯化鈉磷酸鹽溶液洗滌3次,之后再次離心約1500r/min 1min,將細胞壓實,棄去上清液。

3、裂解
將壓實的變形細胞加入約3倍裂解液后使細胞計數在5×1011/L,變形細胞100ml沉淀物加裂解液10ml。然后放置于4℃的冰箱內,每天震蕩2次,以使細胞裂解完-全。析出的液體應透明無色。

4、分裝凍干
將裂解物以3000r/min離心15min,收集上清液分裝于安瓻中,放置于醫用冷凍干燥機中,-30℃快速冷凍,然后于真空狀態下升溫干燥,升溫不超過20℃。冷凍干燥后即可得到標準靈敏度的鱟試劑成品。
三、制品檢測

1、使用凝膠法進行鱟試劑成品內毒素測定,標準內毒素含量為10EU/支,準確加λ無內毒素用水(以下簡稱水)1.0ml,溶解,用封口膜封住安瓿口。

2、將封口安瓿放λ旋渦混合器上旋渦混合,一般情況下國家標準品是20~30min,工作標準品是10~15min(其要求的理由下述會闡明)混合時注意不要使安瓿內溶液沾上封口材料。

3、將混合好的內毒素溶液(此時濃度為10EU/ml)用水稀釋為2λ、λ、0.5λ及0.25λ濃度的系列濃度(λ為靈敏度),即1.0、0.5、0.25、0.125EU/ml濃度的系列溶液。

4、操作方法:①取20支無內毒素試管分為4組,每組分別標記上E1、E0.5、E0.25、 E0.125、E0(空白管陰性對照)。②分別吸取鱟試劑0.1ml 加入E0至E1的對應試管。③E0管加入0.1ml水,其余各管加入0. 1ml與管上標注數字相同濃度的標準內毒素。④用封口膜封閉試管,將試管內容物輕輕搖勻。⑤把試管架放入37±2℃的恒溫水浴中保溫60±2min。在保溫過程中不能有任何震動,以免影響反應的正常進行。保溫時間結束后將試管取出觀察結果,注意,E0管需保溫至4h才取出觀察結果。⑥實驗結果判斷:將試管緩慢翻轉180°,若管內凝膠顯示堅實不變形為陽性,記錄為“+";若無凝膠出現﹐或疑有凝膠但不能保持完整,從管壁滑脫,均判為“陰性",記錄為“-"。



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